Αντι TPO εξαρτήσεις δοκιμής αντισωμάτων αντι Peroxidase θυροειδή της Elisa δοκιμής εξαρτήσεων

Αντιθυρεοειδικό αντι-TPO Peroxidase εξάρτηση της Elisa

1. Προοριζόμενη χρήση

Immunoassay για το τεχνητό ποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων peroxidase θυροειδή στον ανθρώπινο ορό. Ο αντι προσδιορισμός ‐ TPO χρησιμοποιείται ως ενίσχυση στη διάγνωση των αυτοάνοσων ασθενειών θυροειδή.

2. Περίληψη

• Συγκεκριμένο peroxidase θυροειδή ‐ (TPO) είναι παρόν microsomes των thyrocytes και εκφράζεται στην ακραία επιφάνεια κυττάρων του. Στη σύμπραξη με τη θυρεοσφαιρίνη (Tg) αυτό το ένζυμο έχει μια ουσιαστική λειτουργία στην ιωδίωση tyrosine Λ ‐ και της χημικής σύζευξης της κατάληξης μονο iodotyrosine ‐ και Di ‐ για να διαμορφώσει τις ορμόνες θυροειδή T4, T3, και fT3.
• TPO είναι ένα πιθανό autoantigen. Οι ανυψωμένοι τίτλοι ορών των αντισωμάτων σε TPO βρίσκονται με διάφορες μορφές thyroiditis που προκαλούνται από autoimmunity. Ο ακόμα συχνά όρος «microsomal αντίσωμα» προέρχεται από το χρόνο όταν δεν ήταν προσδιορισμένο TPO ακόμα ως αντιγόνο autoimmunity που προκλήθηκε από microsomes. Υπό την κλινική έννοια οι δύο όροι αντι ‐ TPO και το microsomal αντίσωμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ταυτοσήμως υπάρχουν διαφορές, εντούτοις, όσον αφορά τις μεθόδους δοκιμής.
• Οι υψηλοί αντι τίτλοι ‐ TPO βρίσκονται σε μέχρι 90% των ασθενών με thyroiditis χρόνιου Hashimoto. Στην ασθένεια των τάφων, 70% των ασθενών έχουν έναν ανυψωμένο τίτλο. Αν και η ευαισθησία της διαδικασίας μπορεί να αυξηθεί με ταυτόχρονα να καθορίσει άλλα αντισώματα θυροειδή (αντι αντίσωμα δεκτών ‐ ‐ ‐ Tg, TSH - TRAb), μια αρνητική εύρεση δεν αποκλείει τη δυνατότητα μιας αυτοάνοσης ασθένειας. Το μέγεθος του τίτλου αντισωμάτων δεν συσχετίζει με την κλινική δραστηριότητα της ασθένειας. Οι αρχικά ανυψωμένοι τίτλοι μπορούν να γίνουν αρνητικοί μετά από τις μεγάλες περιόδους ασθένειας ή κατά τη διάρκεια της απαλλαγής. Εάν τα αντισώματα επανεμφανίζονται μετά από την απαλλαγή, κατόπιν μια υποτροπή είναι πιθανή.
• Εκτιμώντας ότι οι συνηθισμένες microsomal δοκιμές αντισωμάτων χρησιμοποιούν unpurified microsomes ως προετοιμασία αντιγόνων, οι αντι δοκιμές ‐ TPO χρησιμοποιούν καθαρισμένο peroxidase. Οι δύο διαδικασίες είναι συγκρίσιμης απόδοσης από την άποψη της κλινικής ευαισθησίας, αλλά καλύτερη συνέπεια μερών μερών ‐ σε ‐ και υψηλότερη κλινική ιδιομορφία μπορεί να αναμένεται από τις αντι δοκιμές ‐ TPO λόγω της υψηλότερης ποιότητας του αντιγόνου χρησιμοποιούμενου. Το ένζυμο σύνδεσε immunosorbent δοκιμών χρήσεων τα ανθρώπινα αντισώματα IgG αντιγόνων και κουνελιών αντι-ανθρώπινα (αντι-IgG).

3. Αρχή δοκιμής

Έμμεση μέθοδος, συνολική διάρκεια της δοκιμής: 70 λεπτά.

Το αντι-TPO ELISA υιοθετεί τη στερεά φάση, έμμεση μέθοδος της ELISA για την ανίχνευση των αντισωμάτων σε TPO στη σε δύο στάδια διαδικασία επώασης. Οι λουρίδες πολυστυρολίου microwell είναι προ ντυμένες με τα ιδιαίτερα immunoreactive ανθρώπινα αντιγόνα TPO. Κατά τη διάρκεια του πρώτου βήματος επώασης, τα συγκεκριμένα αντισώματα αντι-TPO, εάν παρόν, θα δεσμευθούν στα καλυμμένα προηγουμένως TPO αντιγόνα στερεάς φάσης. Τα φρεάτια πλένονται για να αφαιρέσουν τις απεριόριστες πρωτεΐνες ορών, και τα αντι-ανθρώπινα αντισώματα IgG κουνελιών (αντι-IgG) που κλίνονται peroxidase ενζυμικού χρένου (κλίση HRP-) προστίθενται. Κατά τη διάρκεια του δεύτερου βήματος επώασης, αυτά τα HRP-κλιμένα αντισώματα θα δεσμευθούν σε οποιοδήποτε αντιγόνο-αντίσωμα (IgG) περιπλέκουν προηγουμένως διαμορφωμένος και η απεριόριστη HRP-κλίση αφαιρείται έπειτα από την πλύση. Chromogen οι λύσεις που περιέχουν το υπεροξείδιο Tetramethylbenzidine (TMB) και της ουρίας προστίθενται στα φρεάτια και στην παρουσία του αντιγόνο-αντίσωμα-αντι-IgG (HRP) immunocomplex, άχρωμα Chromogens υδρολύονται από τη συνδεδεμένη κλίση HRP σε ένα μπλε-χρωματισμένο προϊόν. Το μπλε χρώμα γίνεται κίτρινο μετά από να σταματήσει την αντίδραση με το θειικό οξύ.

Το ποσό έντασης χρώματος μπορεί να μετρηθεί και είναι ανάλογη προς το ποσό αντισώματος που συλλαμβάνεται στα φρεάτια, και προς το ποσό αντισώματος στο δείγμα αντίστοιχα.

4. Υλικά αντιδραστηρίων παρεχόμενα

• Ντυμένο Microplate, 8 λουρίδες της X12, 96 φρεάτια. Καλυμμένος προηγουμένως με το ανθρώπινο αντιγόνο TPO.

• Διακριβωτές, 6 φιαλίδια, 1 μιλ. κάθε, έτοιμο να χρησιμοποιήσει Συγκεντρώσεις: 0 (Α), 25 (Β), 50 (Γ), 100 (Δ), 250 (Ε) ΚΑΙ 500 IU/ML (Φ).

• Ενζυμική κλίση, 1 φιαλίδιο, 11,0 μιλ. του επονομαζόμενου κουνελιού HRP (peroxidase χρένου) αντι ανθρώπινα αντισώματα IgG (αντι-IgG) στον απομονωτή tris-ΝαCl που περιέχει BSA (λευκωματίνη βοοειδών ορών). Περιέχει 0,1% συντηρητικό ProClin300.

• Diluent ορών: 1 φιαλίδιο, 11mL. Περιορισμός των αλάτων απομονωτών και μιας χρωστικής ουσίας

• Συμπύκνωση λύσης πλυσίματος, 1 φιαλίδιο, 25 μιλ. (40X που συγκεντρώνεται), λύση πλυσίματος PBS-Tween.

• Υπόστρωμα, 1 φιαλίδιο, 11ml, έτοιμο να χρησιμοποιήσει, (tetramethylbenzidine) TMB.

• Λύση στάσεων, 1 φιαλίδιο, 6,0 μιλ. 1 θειικού οξέος mol/l.

• IFU, 1 αντίγραφο.

• Καπάκι πιάτων: 2 κομμάτια.

Υλικά που απαιτούνται (αλλά παρεχόμενος)

• Αναγνώστης Microplate με την απορροφητική ικανότητα μήκους κύματος 450nm και 620nm.

• Πλυντήριο Microplate.

• Επωαστήρας.

• Δονητής πιάτων.

• Micropipettes και πολυδιαυλικά micropipettes που παραδίδουν 50µl με μια ακρίβεια καλύτερα από 1,5%.

• Απορροφητικό έγγραφο.

• Αποσταγμένο νερό

5. Διαδικασία δοκιμής

• Η χρήση μόνο ο αριθμός φρεατίων απαίτησε και σχηματοποιεί τα φρεάτια microplate για κάθε διακριβωτή και δείγμα που δοκιμάζονται.

• Προσθέστε 100 µL των διακριβωτών σε κάθε ένας καλά.

• Προσθέστε 100 µL Diluent δειγμάτων (πράσινο χρώμα) σε κάθε ένα καλά εκτός από τα διακριβωτής-φρεάτια.

• Προσθέστε 10 µL του δείγματος σε κάθε Diluent δειγμάτων καλά (ΣΗΜΕΊΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια στα φρεάτια θα γυρίσουν το μπλε χρώμα από πράσινο), κατόπιν κούνημα 30 δευτερόλεπτα.

• Καλύψτε το πιάτο με ένα καπάκι πιάτων και επωάστε σε 37 °C για 30 λεπτά.

• Απορρίψτε το περιεχόμενο του πιάτου μικροϋπολογιστών από τη μετάγγιση ή τη φιλοδοξία. Εάν μεταγγίζοντας, τρυπήστε και λεκιάστε το πιάτο ξηρό με το απορροφητικό έγγραφο.

• Προσθέστε 350 µL της λύσης πλυσίματος, μεταγγίστε (βρύση και λεκές) ή απορροφήστε. Επαναλάβετε 4 πρόσθετες φορές για συνολικά 5 πλυσίματα. Στο τέλος της πλύσης, αναστρέψτε το πιάτο και τρυπήστε έξω οποιαδήποτε υπόλοιπη λύση πλυσίματος επάνω στο απορροφητικό έγγραφο.

• Προσθέστε 100 µL της ενζυμικής κλίσης,

• Καλύψτε το πιάτο με ένα καπάκι πιάτων και επωάστε σε 37 °C για 30 λεπτά.

• Προσθέστε 350 µL της λύσης πλυσίματος, μεταγγίστε (βρύση και λεκές) ή απορροφήστε. Επαναλάβετε 4 πρόσθετες φορές για συνολικά 5 πλυσίματα. Στο τέλος της πλύσης, αναστρέψτε το πιάτο και τρυπήστε έξω οποιαδήποτε υπόλοιπη λύση πλυσίματος επάνω στο απορροφητικό έγγραφο.

• Προσθέστε 100 µL του υποστρώματος σε κάθε ένα καλά. Καλύψτε και επωάστε στην περιβαλλοντική θερμοκρασία (18-25℃) στο σκοτάδι για την αντίδραση για 10 λεπτά. Μην τινάξτε το πιάτο μετά από την προσθήκη υποκράτους.

• Προσθέστε 50 µL της λύσης στάσεων σε κάθε μια καλά.

• Κούνημα για 15-20 δευτερόλεπτα για να αναμίξουν το υγρό μέσα στα φρεάτια. Είναι σημαντικό να εξασφαλιστεί ότι το μπλε χρώμα αλλάζει σε κίτρινο εντελώς.

• Διαβάστε την απορροφητικότητα κάθε μια καλά σε 450 NM (που χρησιμοποιούν 620 έως 630 NM ως μήκος κύματος αναφοράς για να ελαχιστοποιήσει καλά τις ατέλειες) σε έναν αναγνώστη πιάτων μικροϋπολογιστών. Τα αποτελέσματα πρέπει να διαβαστούν μέσα σε 30 λεπτά από την προσθήκη της λύσης στάσεων.