Μέθοδος σάντουιτς ερευνητικής χρήσης εξαρτήσεων CAD Ε Cadherin Elisa ποντικιών Ε μόνο

Ποντίκι ε-Cadherin, εξάρτηση ε-CAD ELISA

Αυτή η εξάρτηση της ELISA χρησιμοποιεί την σάντουιτς-Elisa ως μέθοδο. Το Microelisa stripplate που παρέχεται σε αυτήν την εξάρτηση έχει καλυφθεί προηγουμένως με ένα αντίσωμα συγκεκριμένο για το ε-CAD. Τα πρότυπα ή τα δείγματα προστίθενται στα κατάλληλα φρεάτια Microelisa stripplate και συνδυάζονται στο συγκεκριμένο αντίσωμα. Κατόπιν Peroxidase χρένου (HRP) - το κλιμένο αντίσωμα συγκεκριμένο για το ε-CAD προστίθεται σε κάθε Microelisa stripplate καλά και επωάζεται. Τα ελεύθερα συστατικά πλένονται μακριά. Η λύση υποστρωμάτων TMB προστίθεται σε κάθε μια καλά. Μόνο εκείνα τα φρεάτια που περιέχουν το ε-CAD και κλιμένο το HRP αντίσωμα ε-CAD θα εμφανιστούν μπλε στο χρώμα και θα γίνουν έπειτα κίτρινα μετά από την προσθήκη της λύσης στάσεων. Η οπτική πυκνότητα (OD) μετριέται spectrophotometrically σε ένα μήκος κύματος 450 NM. Η αξία OD είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση του ε-CAD. Μπορείτε να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του ε-CAD στα δείγματα με τη σύγκριση του OD των δειγμάτων με την τυποποιημένη καμπύλη.

Υλικά που παρέχονται την εξάρτηση

Διαδικασία

Διάλυση των προτύπων

τα φρεάτια 1.Ten τίθενται για τα πρότυπα σε ένα Microelisa stripplate. Σε καλά 1 και καλά 2, η τυποποιημένη λύση 100μl και ο τυποποιημένος απομονωτής διαλύσεων 50μl προστίθενται και αναμιγνύονται καλά. Σε καλά 3 και καλά 4, η λύση 100μl από καλά 1 και καλά 2 προστίθεται αντίστοιχα. Κατόπιν ο τυποποιημένος απομονωτής διαλύσεων 50μl προστίθεται και αναμιγνύεται καλά. 50μl η λύση απορρίπτεται από καλά 3 και καλά 4. Σε καλά 5 και καλά 6, η λύση 50μl από καλά 3 και καλά 4 προστίθεται αντίστοιχα. Κατόπιν ο τυποποιημένος απομονωτής διαλύσεων 50μl προστίθεται και αναμιγνύεται καλά. Σε καλά 7 και καλά 8, η λύση 50μl από καλά 5 και καλά 6 προστίθεται αντίστοιχα. Κατόπιν ο τυποποιημένος απομονωτής διαλύσεων 50μl προστίθεται και αναμιγνύεται καλά. Σε καλά 9 και καλά 10, η λύση 50μl από καλά 7 και καλά 8 προστίθεται αντίστοιχα. Κατόπιν ο τυποποιημένος απομονωτής διαλύσεων 50μl προστίθεται και αναμιγνύεται καλά. 50μl η λύση απορρίπτεται από καλά 9 και καλά 10. Μετά από τη διάλυση, ο συνολικός όγκος σε όλα τα φρεάτια είναι 50μl και οι συγκεντρώσεις είναι 24ng/ml, 16 ng/ml, 8 ng/ml, 4ng/ml και 2ng/ml, αντίστοιχα.

2. Στο Microelisa stripplate, αφήστε καλά έναν κενό ως κενό έλεγχο. Στα φρεάτια δειγμάτων, ο απομονωτής διαλύσεων δειγμάτων 40μl και το δείγμα 10μl προστίθενται (ο παράγοντας διαλύσεων είναι 5). Τα δείγματα πρέπει να φορτωθούν επάνω στο κατώτατο σημείο χωρίς να αγγίξουν τον τοίχο φρεατίων. Μίγμα καλά με το ευγενές τίναγμα.

3. Επώαση: επωάστε 30 λ. σε 37℃ μετά από σφραγισμένος με τη μεμβράνη πιάτων περάτωσης.

4. Διάλυση: αραιώστε το συγκεντρωμένο πλένοντας απομονωτή με το αποσταγμένο νερό (30 φορές για 96T και 20 φορές για 48T).

5. Πλύσιμο: προσεκτικά η φλούδα από τη μεμβράνη πιάτων περάτωσης, απορροφά και ξαναγέμισμα με τη λύση πλυσίματος. Απορρίψτε τη λύση πλυσίματος μετά από να στηριχτεί για 30 δευτερόλεπτα. Επαναλάβετε τη διαδικασία πλύσης για 5 φορές.

6. Προσθέστε το HRP-συζευγμένο αντιδραστήριο 50 μl σε κάθε ένα καλά εκτός από τον κενό έλεγχο καλά.

7. Επώαση όπως περιγράφεται στο βήμα 3.

8. Πλύσιμο όπως περιγράφεται στο βήμα 5.

9. Χρωματισμός: Προσθέστε Chromogen 50 μl τη λύση Α και Chromogen 50 μl τη λύση Β σε κάθε ένα καλά, αναμίξτε με ήπια να τινάξει και επωάστε σε 37℃ για 15 λεπτά. Παρακαλώ αποφύγετε το φως κατά τη διάρκεια του χρωματισμού.

10. Λήξη: προσθέστε τη λύση στάσεων 50 μl σε κάθε μια για να ολοκληρώσετε καλά την αντίδραση. Το χρώμα πρέπει καλά να αλλάξει από μπλε σε κίτρινο.

11. Διαβάστε την απορροφητικότητα O.D. σε 450nm χρησιμοποιώντας έναν Microtiter αναγνώστη πιάτων. Η αξία OD του κενού ελέγχου καλά τίθεται ως μηδέν. Η δοκιμή πρέπει να πραγματοποιηθεί μέσα σε 15 λεπτά μετά από να προσθέσει τη λύση στάσεων.

Ακρίβεια

Ακρίβεια δια--δοκιμής (ακρίβεια μέσα σε μια δοκιμή): 3 δείγματα με το χαμηλό, μέσο και υψηλού επιπέδου ε-CAD εξετάστηκαν 20 φορές σε ένα πιάτο, αντίστοιχα.

Ακρίβεια διά-δοκιμής (ακρίβεια μεταξύ των δοκιμών): 3 δείγματα με το χαμηλό, μέσο και υψηλού επιπέδου ε-CAD εξετάστηκαν σε 3 διαφορετικά πιάτα, 8 αντιγραφές σε κάθε πιάτο.

Βιογραφικό σημείωμα (%) = SD/meanX100

Δια--δοκιμή: Βιογραφικό σημείωμα<10>

Διά-δοκιμή: Βιογραφικό σημείωμα<12>

Σειρά δοκιμής

0.6pg/ml -80pg/ml

Ευαισθησία:

0,1 pg/ml