MPXV PCR Monkeypox Virus Παγώσιμος στεγνός πολλαπλός εντοπισμός PCR σε πραγματικό χρόνο

ΕΠΙΚΑΛΗΣΗ ΕΠΙΚΑΛΗΣΗ

1) Εξόρυξη νουκλεϊκού οξέος Εξόρυξη DNA από δείγματα χρησιμοποιώντας κατάλληλο εξοπλισμό εξαγωγής.Συνιστάται το νουκλεϊκό οξύ να ελαθεί με περίπου 100 μl αποθέματος ασφαλείας ελαύσεως (TE ή H2O χωρίς νουκλεάση) στο τελικό στάδιο της εκχύλισης.Το καθαρισμένο νουκλεϊκό οξύ πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως ή να φυλάσσεται σε θερμοκρασία - 20°C.

2) Προετοιμασία θετικού ελέγχου Το θετικό έλεγχο μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από την επανυδάτωση για έως και 12 μήνες.Πρέπει να επαναυδατώνεται πριν από τη χρήση προσθέτοντας 250 μl tampon TE ή H2O χωρίς νουκλεάσηΧρησιμοποιήστε αμέσως ή αποθηκεύστε στους - 20 °C.

3) Προετοιμασία μείγματος RT-PCR σε πραγματικό χρόνο

Α) Ανοίξτε την συσκευασία κενού και αφαιρέστε τις ταινίες 8 σωλήνων που περιέχουν το αντιδραστήρα.Εάν οι παρεχόμενοι σωλήνες δεν είναι συμβατοί με το όργανο σας, μεταφέρετε το σφαιρίδιο αντιδραστήρα σε έναν οπτικό σωλήνα συμβατό με το όργανο σας.

Β) Ανοίξτε τους σωλήνες και πετάξτε το καπάκι (δεν είναι κατάλληλο για μηχανές PCR σε πραγματικό χρόνο) και προετοιμάστε το μείγμα αντίδρασης στον πάγο όπως παρακάτω

* Χωρίς νουκλεάση νερό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικό έλεγχο.

Γ) Σφραγίστε τους σωλήνες με οπτικά καπάκια ή με πλάκα 96 ορυκτών με οπτική ταινία σφραγίσματος (δεν παρέχεται).

Δ) Στρογγυλοποιήστε τους σωλήνες σε χαμηλή ταχύτητα για 10 ~ 15 δευτερόλεπτα και φυγοκεντρώστε τους σε 3000 στροφές ανά λεπτό για 20 δευτερόλεπτα και τοποθετήστε τους σε ένα όργανο PCR σε πραγματικό χρόνο.

3) Εγκατάσταση RT-PCR: ορίστε τον όγκο αντίδρασης σε 25μl και τη διαδικασία ενίσχυσης PCR όπως παρακάτω.Φθορισμός ROX (για το Orf1ab) και CY5 (για το γονίδιο RNase P) στους 60 °C, και επιλέξτε το NONE ως παθητική αναφορά.
4) Ανάλυση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων Ορίστε το όριο σύμφωνα με τις οδηγίες του οργάνου.

Α) Έλεγχος ποιότητας:

Β) Ερμηνεία των αποτελεσμάτων δειγματοληψίας

Τεχνικές παραμέτρους: